染色質免疫沉淀后測序(ChIP seq)是一種針對DNA結合蛋白、組蛋白修飾或核小體的全基因組分析技術。由于二代測序技術的巨大進步，ChIP-seq比其最初版本ChIP-chip具有更高的分辨率、更低的噪聲和更大的覆蓋范圍。隨著測序成本的降低，ChIP- seq已成為研究基因調控和表觀遺傳機制不可或缺的工具。

1. 原理  

甲醛處理細胞使目標蛋白與DNA交聯，通過超聲波將交聯后的染色質打斷成小片段，一般在200-600bp范圍內。再利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來。最后，去交聯并對純化后DNA進行PCR擴增，高通量測序，最后與已有基因組序列進行比對，以確定 DNA與蛋白質結合的序列。

2.問題分析

2.1.甲醛交聯對后續結果分析的影響？

自從Orlando V等人首次發明了ChIP技術，十幾年后核心步驟仍無大變化。然而，ChIP-seq技術實際存在一定的缺陷，例如甲醛交聯。甲醛雖然是一種高度滲透的交聯劑，但由于其反應活性僅限于胺，因此其交聯效率較低；對哺乳動物細胞而言，其最大交聯效率僅為1%。因此甲醛交聯細胞所需的起始量很大，也因此該技術也很難適用于微量細胞及單細胞樣本。牛津大學出版社發表的文章In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis指出，某些蛋白質如：阻遏蛋白，NF-κB等無法通過甲醛交聯到DNA上，研究表明；在DNA上的停留時間短于5秒的蛋白質無法用甲醛交聯。其次，甲醛會導致許多其它無關蛋白質交聯到DNA上，影響后續分析數據。有報道稱，甲醛交聯會觸發DNA損傷應答機制，從而改變染色體組分，進而使ChIP結果產生偏向性。除此之外，由于交聯反應在加熱和低PH的情況下會發生逆轉，因此DNA蛋與白質的交聯復合物的穩定性也是一個值得關注的問題。因此，甲醛究竟在多大程度上能反應細胞內蛋白質的分布仍不能確定。

根據有無甲醛交聯步驟可以把CHIP技術劃分為兩種類型，一類是存在甲醛交聯的 ChIP，即X-ChIP（cross-linking and mechanical shearing ChIP）；另一類是無交聯存在的ChIP，即N-ChIP（native-ChIP）；相較于X-ChIP，N-ChIP技術有一系列的優點，包括：高分辨率（MNase的使用使得染色體的片段化可以小至核小體）、避免了甲醛交聯帶來的非特異性蛋白在DNA上的富集、避免了甲醛交聯對抗原表位的遮蓋、步驟的減少降低了樣品的損失等。然而，由于使用了MNase，N-ChIP只適用于研究組蛋白修飾，大部分情況下不能用于轉錄因子的研究。

2.2. 超聲波打斷和酶斷裂方法的比較？

酶類：最常用的酶類如MNase，即：微球菌核酸酶，是一種能降解核小體連接區的DNA序列的核酸酶，最初從金黃色葡萄球菌中分離出來。MNase消化染色質可以釋放出一個個獨立的核小體。

MNase酶解法具有一定的局限性，首先，MNase對于偏向于切割A/T堿基位點，導致核小體在A/T富集區域的表達量低于真實情況；其次，MNase不能在核小體邊界精確切割，這導致在確定染色質的開放位置與真實情況存在差異；而且，MNase偏向于消化脆性核小體。在不同物種的實驗證據表明，脆性核小體占據了基因啟動子和轉錄終止位點，而脆性核小體只在MNase濃度較低且消化時間較短的情況下才能被檢測出來，因此很難將脆弱核小體量化到穩定核小體的相對豐度。

超聲打斷則不如酶裂解法溫和，而且由于打斷的不均勻性，導致測序結果背景噪音高，影響后續數據分析。由于文章篇幅限制，在此不多贅述。

那么究竟選擇酶解還是超聲打斷，需要視情況而定。可參考以下建議：

如果所研究的蛋白質高豐度表達且與DNA結合緊密如組蛋白，那么樣本無需需交聯，這時可使用酶解法。

如果所研究的蛋白質表達豐度較低或與DNA結合不緊密如轉錄因子等，往往需要用交聯試劑將樣本進行固定，穩定蛋白質和DNA的形態，這時最好選用超聲法進行斷裂。

3.拓展  

3.1適用于微量細胞水平的ChIP技術及其原理

（1）CUT-Tag技術

CUT-Tag可同時用于研究轉錄因子結合位點以及DNA的開放性。可在一天之內完成從細胞到建庫完成的所有步驟，且具有高分辨率，低噪音等特點。起始細胞用量可低至50個。

原理

利用抗原抗體特異性反應，加入特異性抗體與染色體上目標蛋白結合，加入二抗與該抗體結合以募集更多的pA-Tn5轉座酶復合物至目標蛋白與DNA序列的結合位點上，轉座酶復合物切割該染色質開放位點，并在切割后的DNA片段兩端加入接頭，文庫構建完成，可直接進行后續測序，與已有基因組序列比對，即可知道目標蛋白與DNA的結合位點。

（2）ChIL-seq

ChIL（chromatin integration labelling），即染色質集成標簽技術，可同時用于研究轉錄因子結合位點以及DNA的開放性，起始細胞用量為100-1000個細胞。ChIL-seq 避免了傳統ChIP-seq技術中由于抗體沉淀所帶來的回收率低的缺陷，尤其適用于貼壁細胞。對于活躍的組蛋白標記如H3K4me3 ，H3K27ac，起始細胞用量甚至可降低至單細胞水平。

原理

在96孔板中加入細胞，經固定，染色后加入一抗與目標蛋白結合，隨后加入ChIL探針（由二抗和ChIL DNA組成），探針中的ChIL DNA經Tn5轉座酶整合到目標蛋白所在基因組DNA附近，隨后T7 RNA 聚合酶經ChIL DNA中的啟動子啟動轉錄，以此處基因組DNA為模板合成RNA，經DNase I消化和裂解釋放RNA，以純化的RNA建庫測序。

（3）Drop-ChIP

Drop-ChIP:使用了特定的微流控裝置，分辨率可達到單細胞水平。該技術不僅可以在單細胞水平研究轉錄因子結合位點及組蛋白修飾，還可以從細胞特異性角度研究不同細胞間染色質的變異程度。我們認為，整合單細胞染色質和單細胞表達數據，可以使調控元件與靶基因更精確地耦合，并更深入地了解它們的功能動力學和關系。

原理

首先，將待研究的細胞與裂解液，MNase混合進行染色質消化，另外設計一個包含很多種不同接頭的液滴，在微流控裝置上反應，使得每一個細胞液滴與一種接頭液滴混合，同時與含有DNA連接酶的buffer液滴混合。這個過程中，接頭序列自動連接到裂解的染色質片段兩端，進而進行細胞裂解，使用特異性抗體對目標蛋白進行沉淀，對富集后的DNA進行測序。與已有基因組序列比對即可知道目標蛋白作用位點。

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