紙芯片微流控技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用
紙芯片微流控(Paperbasedmicrofluidics)或微流控紙基分析設(shè)備(Microfluidicpaper-basedanalyticaldevices，μPADs)簡(jiǎn)稱(chēng)紙芯片，是微流控芯片中的最新發(fā)展領(lǐng)域，由Whitesides研究組［4］在2007年首次提出。紙芯片是以紙代替?zhèn)鹘y(tǒng)的石英、玻璃、硅、高聚物等材料，在紙的表面加工出具有一定結(jié)構(gòu)的微流體通道的微型分析器件，結(jié)合了微流控技術(shù)和紙的優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)的微流控芯片相比，紙芯片具有以下優(yōu)勢(shì)［5－9］:①紙來(lái)源豐富，可進(jìn)行批量生產(chǎn);②不需要外接泵，紙的主要成分是纖維素，流體在紙上通過(guò)毛細(xì)作用流動(dòng);③試樣消耗量更低;④檢測(cè)背景低，有利于光度法檢測(cè);⑤生物兼容性好，可通過(guò)化學(xué)修飾改變紙的性質(zhì);⑥一次性便攜式分析，操作簡(jiǎn)便，甚至不需要專(zhuān)業(yè)的操作人員。紙芯片為臨床診斷、環(huán)境監(jiān)控以及食品安全分析中需要的便攜式檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供了一個(gè)廣闊的平臺(tái)。此外，對(duì)于醫(yī)護(hù)人員和醫(yī)療設(shè)備緊缺的欠發(fā)達(dá)地區(qū)，紙芯片是低成本、檢測(cè)迅速的即時(shí)診斷(Point－of－caretesting，POCT)的有力工具。
紙芯片的發(fā)展可追溯到17世紀(jì)，英國(guó)化學(xué)家羅伯特·波義耳偶然發(fā)現(xiàn)石蕊地衣中提取的紫色浸液遇酸變紅色，遇堿變藍(lán)色，并利用這一特點(diǎn)制成了酸堿試紙———石蕊試紙。1949年，Müller及其同事用石蠟浸漬濾紙形成一定的通道，發(fā)明了用于洗脫色素的紙上薄層色譜［10］。從此以紙為載體的分析診斷設(shè)備開(kāi)始出現(xiàn)。其中，以驗(yàn)孕棒為代表的免疫色層分析試紙，即側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)(Lateralflowassays，LFAs)［11］是紙芯片技術(shù)發(fā)展中的一塊里程碑。市面上陸續(xù)出現(xiàn)用于檢測(cè)糖尿病、病原體生物標(biāo)志及其他傳染病的紙基即時(shí)診斷設(shè)備［12－13］。這類(lèi)檢測(cè)主要包括樣品墊、結(jié)合墊、檢測(cè)墊以及吸收墊。具體原理是向樣品墊加樣后，樣品溶液在毛細(xì)作用下流經(jīng)結(jié)合墊，預(yù)先加入并干燥的帶有信號(hào)指示劑的抗體和目標(biāo)抗原結(jié)合，形成抗原/信號(hào)－抗體結(jié)合物，共同流向檢測(cè)墊，隨后和固定在檢測(cè)墊表面的捕獲抗體結(jié)合，從而獲得信號(hào)輸出。吸收墊用于吸收樣品溶液，從而可以增加進(jìn)樣量進(jìn)而提高檢測(cè)的選擇性。其中，彩色乳膠微球或金納米顆粒常被作為信號(hào)分子［14］。此類(lèi)試紙檢測(cè)因操作簡(jiǎn)單、成本低且攜帶方便而取得了巨大成功。然而，側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)對(duì)樣品量需求大，且不適用于多重分析和定量分析［15］。而紙芯片的出現(xiàn)突破了傳統(tǒng)試紙檢測(cè)的局限，使低成本、低耗樣量的便攜化定量檢測(cè)成為了可能。圖1羅列了紙芯片發(fā)展過(guò)程中的里程碑事件。圖2為不同時(shí)期的紙基芯片示意圖。
圖1紙芯片微流控技術(shù)發(fā)展的里程碑事件
一、紙芯片的制作
紙芯片制作的基本原理是在紙面上形成通道從而實(shí)現(xiàn)對(duì)流體的引導(dǎo)。根據(jù)形成通道的方法不同可以分為以下幾類(lèi):直接切割制成通道;在濾紙上修飾諸如石蠟、光刻膠、烷基烯酮二聚體等疏水性材料形成通道;使用聚二甲硅氧烷、聚苯乙烯或聚亞胺酯等聚合物來(lái)封閉多孔結(jié)構(gòu)從而形成物理屏障。其中，在濾紙上用疏水性材料形成通道是目前最常用的方法，但該方法不適于含有膽固醇等親油性物質(zhì)的試樣。
除了濾紙外，根據(jù)不同需要，其他類(lèi)型的紙也可以被用作紙芯片的基底。例如，硝化纖維膜對(duì)生物分子有較高的非特異吸附，適合固定DNA［24］、酶［16］以及蛋白質(zhì)［25］等生物分子;蠟光紙韌性好、降解性低、表面光滑，可在其表面固定納米粒子［26］;紙巾的吸水性強(qiáng)，固定凝聚血細(xì)胞效果好［27］。
1.常用的制作方法
手工加工
①蠟畫(huà) Lin等嘗試直接用蠟筆繪制圖案以及用蠟筆臨摹打印出的圖案這兩種方法該方法簡(jiǎn)單省時(shí)，不需要昂貴的儀器并且無(wú)需專(zhuān)業(yè)人員操作，但僅適用于圖形簡(jiǎn)單的紙芯片制作。
②聚合物油墨繪畫(huà)或壓印Whitesides等先將光膠涂在濾紙上，然后貼上透明膠帶，用筆直接在膠帶上繪制圖案，經(jīng)紫外光照射后再撕下透明膠帶，得到印有圖案的紙芯片(圖3B)。該方法不需要使用模具，簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的光刻制作法。
③石蠟壓印DeTarsoGarcia等使用金屬印戳在涂滿(mǎn)石蠟的濾紙上一步制成樹(shù)枝狀的紙芯片圖案，進(jìn)一步用比色法進(jìn)行檢測(cè)(圖3C)。該方法快速省時(shí)，成本低且可以大批量生產(chǎn)。
模具加工
①石蠟浸漬Laiwattanapaisal等將鐵制模具放置于平鋪在載玻片的濾紙上，并在載玻片的背面放上一塊磁鐵，然后浸入液態(tài)蠟中，待冷卻后再取出濾紙，從而得到相應(yīng)圖形(圖3D)。該方法成本低，但需要模具，并且難以控制浸漬蠟的時(shí)間，重現(xiàn)性較差。
②光刻法Whitesides課題組［4］最早利用光刻法制作紙芯片。將SU－8光膠涂在濾紙表面并甩勻后，利用紫外燈照射，根據(jù)透明模具的形狀對(duì)光膠進(jìn)行聚合，形成通道，再洗去未交聯(lián)的光膠，從而得到高分辨圖案(圖3E)。該成果是紙芯片研究領(lǐng)域的一大突破，為簡(jiǎn)便、廉價(jià)以及可攜帶的檢測(cè)應(yīng)用提供了一種可能。但光刻制作步驟繁瑣，成本高并易受背景影響。
③石蠟絲網(wǎng)打印Henry等［32］在絲網(wǎng)印刷模具上印上石蠟固體，然后加熱融化，形成疏水阻擋層，從而制得紙芯片(圖3F)。該方法成本低，操作方便，可批量生產(chǎn)，但石蠟在紙上不均勻的沉積會(huì)導(dǎo)致分辨率較低。
打印
①石蠟打印石蠟打印法是目前最常用的方法，由Lin等首次報(bào)道，Whitesides等進(jìn)一步建立了石蠟在濾紙表面加熱融化的速率計(jì)算模型。具體操作為先用石蠟打印機(jī)打印預(yù)先設(shè)計(jì)的圖案，然后加熱使石蠟融化滲透至濾紙中，形成疏水阻擋層(圖3G)。其中，XeroxPhaser8560N石蠟打印機(jī)使用最廣泛，其石蠟?zāi)?20℃開(kāi)始融化，便于后續(xù)的加熱操作。該方法快速(5min內(nèi)完成)、簡(jiǎn)單、成本低(打印一張8.5英寸×11英寸WhatmanNo.1濾紙的成本為0.60美元)，特別適于大批量生產(chǎn)對(duì)分辨率要求不高的紙芯片。
②噴墨侵蝕Citterio等先用聚苯乙烯浸潤(rùn)濾紙，然后將甲苯反復(fù)打印在特定區(qū)域以除去表面的聚苯乙烯，從而形成親水通道，再在相應(yīng)區(qū)域打印化學(xué)或生物試劑，用于后續(xù)檢測(cè)(圖3H)。該方法能夠在繪制圖案的同時(shí)固定反應(yīng)試劑，但不適合批量生產(chǎn)。
③噴墨打印Li等［23］先用噴墨打印機(jī)在設(shè)計(jì)的圖案上打印AKD材料以將濾紙部分疏水化，然后再加熱，確保打印區(qū)域完全疏水化，從而形成通道(圖3I)。此方法不需要模具，可批量生產(chǎn)。
④柔印Erho等［34］通過(guò)柔印打印將聚苯乙烯滲入濾紙，形成疏水壩，而未被打印的區(qū)域依然保持親水性，從而形成通道(圖3J)。該方法雖然快速，可批量生產(chǎn)，但加工過(guò)程復(fù)雜，需要不斷重復(fù)以確保通道完全疏水化。
切割
①工藝刀切割工藝刀切割［35］是利用電腦控制刀，根據(jù)不同的切割力度和角度制作相應(yīng)的圖案，但通常要在底部加上保護(hù)層以避免濾紙被割破(圖3K)。與手工切割方法相比，該方法不僅提高了分辨率，還在制作時(shí)間和生產(chǎn)數(shù)量方面有了進(jìn)一步優(yōu)化。
②激光切割激光切割［36－38］(圖3L)不需要在底部加上保護(hù)層，但制備成本大，需要專(zhuān)門(mén)的激光切割儀器。Crooks等［39］利用激光切割法將設(shè)計(jì)的通道切除，形成中間鏤空的夾心型紙芯片傳感器，大大提高了流體在紙芯片的流動(dòng)速度。
圖3紙芯片的制作方法原理圖
2.3D紙芯片
傳統(tǒng)的2D紙芯片無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量、多靶標(biāo)、多步反應(yīng)的檢測(cè)，并且容易產(chǎn)生試劑的交叉污染。而3D紙芯片的出現(xiàn)突破了2D紙芯片的局限，能夠集成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)通道，并實(shí)現(xiàn)樣品的快速分配等。3D紙芯片具有多層結(jié)構(gòu)，其常用的制作方法有兩種，利用雙面膠將平面圖案多層疊加固定或手工折疊。
Whitesides等用雙面膠固定多層印有不同圖案的紙，設(shè)計(jì)了一個(gè)用于同時(shí)檢測(cè)葡萄糖和蛋白質(zhì)的3D紙芯片。該紙芯片的最上層有4個(gè)加樣口，底部含有16個(gè)檢測(cè)區(qū)。加入待測(cè)樣品后，樣品在毛細(xì)作用下達(dá)到最底層，與檢測(cè)區(qū)預(yù)先加入的試劑反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可直接觀(guān)察的顏色變化。該設(shè)計(jì)將復(fù)雜的反應(yīng)通道隱藏在裝置中，只呈現(xiàn)最終的檢測(cè)區(qū)域，便于結(jié)果的讀取和分析(圖4A，B)。而Crooks等［21］利用折紙的方法，同時(shí)用比色法和熒光法檢測(cè)葡萄糖和蛋白質(zhì)。該設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)在于3D結(jié)構(gòu)的紙芯片可以隨時(shí)還原至平面結(jié)構(gòu)，并任意一層進(jìn)行定量或半定量分析(圖4C)。此外，Lewis等［43］發(fā)明了一種快速批量制作3D紙芯片的方法，先用石蠟打印機(jī)批量制作平面圖案，然后用噴霧膠粘貼一層空白濾紙，打印新的圖案，再重復(fù)以上步驟。此方法可一次性制造200～300個(gè)3D紙芯片，簡(jiǎn)單高效。
圖4 3D紙芯片示意圖
二、基于紙芯片的檢測(cè)方法
紙芯片常用的檢測(cè)方法主要有光度檢測(cè)法、熒光法、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光法，以及電化學(xué)檢測(cè)法。其中，光度檢測(cè)法和電化學(xué)方法目前應(yīng)用最為廣泛。
光度檢測(cè)法
光度檢測(cè)法是最直觀(guān)、最常用的一種方法。該方法通過(guò)顯色反應(yīng)，如酶聯(lián)反應(yīng)、基于納米粒子或量子點(diǎn)的顏色變化，將待測(cè)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為有顏色的物質(zhì)，根據(jù)顏色變化的程度和待測(cè)樣品濃度的關(guān)系，進(jìn)行半定量或者定量分析。可利用肉眼觀(guān)察進(jìn)行半定量分析，但通常會(huì)因?yàn)椴煌瑱z測(cè)者的視覺(jué)感官不同而產(chǎn)生誤差。因此需進(jìn)一步借助掃描儀、相機(jī)將檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)為圖片，然后用ImageJ、PS等圖像處理軟件將顏色轉(zhuǎn)化為灰度值，再根據(jù)灰度值和待測(cè)物濃度的關(guān)系進(jìn)行定量分析。該方法的局限在于易受光線(xiàn)的影響，靈敏度和選擇性不及電化學(xué)方法。目前，光度檢測(cè)法主要用于：生物分子、離子、血液標(biāo)本等。
熒光法
熒光法的選擇性好、檢出限低，但需要借助外接儀器，并受紙中熒光素產(chǎn)生的背景干擾。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，利用熒光法可在紙芯片上檢測(cè)蛋白質(zhì)、細(xì)菌］以及DNA。
化學(xué)發(fā)光法
化學(xué)發(fā)光法是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)在某個(gè)時(shí)刻發(fā)射的光強(qiáng)度來(lái)確定反應(yīng)中某一組分濃度的方法。該方法靈敏度高、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、線(xiàn)性范圍寬、重現(xiàn)性好，可在黑暗環(huán)境中操作并可結(jié)合微加工技術(shù)進(jìn)行分析。
電化學(xué)發(fā)光法
電化學(xué)發(fā)光法是將化學(xué)發(fā)光法與電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的一種新型技術(shù)，利用電化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行發(fā)光，光學(xué)背景信號(hào)低、反應(yīng)可控性強(qiáng)，通過(guò)控制電極電位可調(diào)節(jié)檢測(cè)的選擇性，具有良好的應(yīng)用前景。
電化學(xué)方法
電化學(xué)方法的靈敏度高、選擇性好，檢測(cè)區(qū)不受光線(xiàn)的影響，耗樣量少，成本低，易于集成，并且技術(shù)成熟，已被廣泛應(yīng)用于葡萄糖、膽固醇、維生素C、DNA及核酸、離子及氣體等物質(zhì)的檢測(cè)。
紙芯片微流控技術(shù)因其廉價(jià)、高效、耗樣量少、便攜、制作簡(jiǎn)單、操作方便等優(yōu)勢(shì)引起廣泛關(guān)注，其設(shè)計(jì)符合世界衛(wèi)生組織(WHO)針對(duì)在欠發(fā)達(dá)地區(qū)使用的診斷設(shè)備提出的“ASSUＲED”原則［98］，并已被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，紙芯片手機(jī)［16］等移動(dòng)設(shè)備的結(jié)合促進(jìn)了遠(yuǎn)程醫(yī)療以及家庭護(hù)理的發(fā)展。該體系的優(yōu)點(diǎn)在于提高了即時(shí)診斷的便攜性和普遍性，使現(xiàn)場(chǎng)采集的數(shù)據(jù)能夠通過(guò)移動(dòng)設(shè)備傳送到分析中心，從而避免了試樣運(yùn)輸帶來(lái)的麻煩。迄今為止，紙芯片與移動(dòng)設(shè)備聯(lián)用體系已經(jīng)成功用于噬菌體和細(xì)菌病原體［99－100］、藥物［101］、生物標(biāo)記物［51，102］、有毒金屬［103］以及爆炸物［104］等物質(zhì)的檢測(cè)。但該體系易受外界光線(xiàn)影響，導(dǎo)致圖案色彩強(qiáng)度前后不一致。為了解決此問(wèn)題，許多課題組開(kāi)始設(shè)計(jì)手機(jī)圖像校正軟件［105］或擋光器件［106］。
作為一門(mén)新型技術(shù)，紙芯片微流控領(lǐng)域還有許多課題有待研究，如:開(kāi)發(fā)更多類(lèi)型的紙芯片擴(kuò)大其應(yīng)用范圍;尋找更簡(jiǎn)單、廉價(jià)的制作方法;將紙芯片和新型材料結(jié)合增強(qiáng)生物兼容性以實(shí)現(xiàn)紙芯片的商品化;研究流體在紙芯片上的驅(qū)動(dòng)機(jī)理，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的控制;與更多的檢測(cè)方法結(jié)合;延長(zhǎng)試劑在紙芯片上的儲(chǔ)存時(shí)間及紙芯片的壽命;與檢測(cè)儀器集成實(shí)現(xiàn)便攜化檢測(cè);提高紙芯片檢測(cè)的重現(xiàn)性和檢出限;優(yōu)化檢測(cè)結(jié)果的輸出形式使紙芯片方便非專(zhuān)業(yè)人士的使用;減小外界環(huán)境對(duì)檢測(cè)的影響等。
通過(guò)不斷的優(yōu)化，紙芯片微流控將不局限于欠發(fā)達(dá)地區(qū)的醫(yī)療診斷，還可以為發(fā)達(dá)地區(qū)的現(xiàn)場(chǎng)急救、臨床試驗(yàn)、醫(yī)療保健提供低成本的診斷途徑，并在臨床診斷、食品安全分析以及環(huán)境監(jiān)控等領(lǐng)域有著良好的發(fā)展前景。
文獻(xiàn)：紙芯片微流控技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用（田 恬，黃藝順，林冰倩，魏曉峰，周雷激，朱 志，楊朝勇*） doi: 10. 3969 / j. issn. 1004 － 4957. 2015. 03. 002
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