Q1：請問下高通量測序相對基因芯片有何優勢？

A：高通量測序有如下優點：

1、準確性高，可重復性高；

2、不僅能對已知的基因進行檢測，還能對新基因進行尋找；

3、對基因表達量的檢測限更廣（對高豐度和低豐度基因的檢測更加準確）

4、直接得到基因序列，原始數據不會受基因組的版本號變化的影響（芯片原始數據為探針信息，可能因為基因組升級導致注釋信息變化而失效）。因此，測序更加適合于實驗室樣本數據的長期累積和分析

 

Q2：我想對某種海洋生物的育種進行研究，但該海洋生物的基因組數據一直沒有公布，請問是否可以通過轉錄組測序來篩選分子標記？

A：可以，我們通過轉錄組測序可以對樣本個體SSR等分子標記進行檢測。同時，也可以建議老師采用RAD測序來進行分子標記的篩選。

 

Q3：轉錄組測序的取樣時實驗室沒有液氮了，能否將樣品直接至于-80℃冰箱中保存？

A：不能，因為RNA暴露在富含RNA酶的環境中極易降解，需要迅速至于液氮中，并低溫保存，而冰箱無速凍功能。

 

Q4：沒有基因組的物種，可以憑借轉錄組數據做可變剪切的預測么？

A：不能，預測可變剪切需要有參考基因組。

 

Q5：我拿到了我的表達譜測序結題報告，顯示差異基因有好幾千個，請問我怎樣才能找到感興趣的某功能基因？一個一個找嗎？

A：如果老師已經鎖定感興趣的代謝通路，可以點開結題報告中kegg富集分析，選擇該代謝通路的超鏈接，打開基因列表，查看該通路中的差異表達基因，如果仍然過多，老師您可以點開路徑名的超鏈接，在路徑圖中選擇位于上游的差異基因。

 

Q6：差異基因的篩選條件為何是在兩個樣品中的表達量相差大于二倍？

A：表達量差異倍數的設置是根據老師的研究需要設定的，目的是找到合適數量的差異基因，并無硬性指標。二倍的差異是國際雜志認可的篩選標準。如果老師認為得到的差異基因數過多，可以自行提高差異倍數。具體可以咨詢基迪奧的技術人員。

 

Q7：你們的轉錄組結題報告為何沒有關于mRNA可變剪接的統計結果？

A：對于無參考基因組的物種，轉錄組測序的結果是無法區分可變剪切和基因家族的，我們不知道兩個相似序列是否來自同一個基因，所以轉錄組測序結果不包含可變剪切的分析。

 

Q8：如何判斷基因表達量測定結果的好壞？

A：有如下方法:一，觀察結題報告中的測序及比對結果是否正常；二，正常情況下兩樣品差異比較得到的上調基因和下調基因的數目應基本在一個數量級；三，可以通過比較兩樣品中物種組成型表達的基因（看家基因）的表達量，正常情況下應基本一致。我們都會在將結果呈遞給老師前對結果進行檢驗，老師可以放心使用。

 

Q9：我想在ncbi數據庫中下載的某物種轉錄組測序結果，請問具體方法是什么？

A：在ncbi數據庫中，轉錄組測序的reads信息被壓縮為SRA格式，在ncbi搜索物種，可以在搜索的SRA欄目中找到測序信息和下載鏈接。下載下來的數據需要使用SRA轉換工具來轉換成分析軟件需要的FASTQ格式。

 

Q10：我研究的物種沒有參考基因組，一共六個樣品。我準備分別進行混樣轉錄組測序，再進行表達譜測序，你們還有更好的辦法嗎？

A：老師您的方法是合理的，對混樣進行轉錄組測序，盡可能得到完全的轉錄組數據，以此為參考序列，進行表達譜測序。但我們有更好的辦法。老師可以選擇對合樣品進行pe100測序，測序量為2G，然后將表達譜測序的結果混合后進行組裝，同樣可以得到轉物種的轉錄組。

 

Q11：我在貴公司進行了測序，現在正在進行論文撰寫，到關于你們的測序方法與結果不甚了解，請問你們能否提供相關幫助？

A：我們有對我們的各業務線的圖表結果及其實驗分析方法進行了撰寫，并參考在知名sci雜志上發表的論文對文檔進行了翻譯。老師可以聯系我們的銷售來獲取這些文檔。

 

Q12：在lncRNA分析中，你們是如何分析其對基因的調控的？

A：由于目前對lncRNA的功能機制的研究尚未明確，現在我們一般采用lncRNA順式調控假說的方法原理，將lncRNA附近10kb的區域中包含的基因作為潛在的lncRNA相關基因，如果同時進行了表達譜測序，我們可以通過這些基因與lncRNA間的共表達關系對之進行篩選，得到更可信的lncRNA與基因調控網絡。

 

Q13：對于一個未知物種而言，如果做轉錄組denovo項目，一般有多少個unigene比較合適？

A：物種的轉錄組unigene數目因為物種的不同可能有顯著不同，考慮到每個基因有可能產生多個轉錄本的情況，結合目前的項目經驗，一般物種的unigene數目為基因數的2-4X比較合適。

 

Q14：計劃研究一個物種（基因組未發表），想了解一下其基因組的基本信息，請問有哪些途徑？

A：可以通過查詢相關網站數據獲知，例如Animal Genome Size Database，PlantGDB,Plant DNA C-values Database等。

 

Q15：對于某個物種，做過兩次獨立的轉錄組組裝，如何知道兩次結果中的unigene的對應關系？

A：可以但是一般老師通常關注的是某類基因，而且老師往往已經在一個轉錄組結果中找到，那么可以建議老師通過本地blast，將所要查詢的基因與另一個轉錄組數據進行匹配，將對應unigene找出。

 

如果數量巨大，我們將提供大批量blast的個性化分析服務。

 

Q16：做多個樣本的RNA-seq項目，兩兩比較中有某個樣品的基因表達量上調和下調基因數目相差很多（兩個數量級），是否正常？

A：理論上講，一個細胞的RNA總量是比較穩定的，那么通常情況下，上調和下調的基因數一般不應該差別很多，如果差別一個數量級以上，可以考慮查證是否在樣品中存在的rRNA或者其他物種RNA污染的影響。

 

Q17：如果要做一個未知物種的轉錄組高通量測序項目，應該怎么來選擇測序平臺及數據量？

A：Illumina測序平臺因其穩定的測序質量，優質數據性價比，占領了市場80%以上的份額。數據量我們一般推薦做4-8G（這個也不是固定標準，隨著行業發展會變化，而且不同的老師可能有不同的需要）

 

Q18：目前做高通量測序項目是否必須設置生物學重復？

A：理論上講，設置生物學重復是比較合理嚴謹的做法，如果老師的經費允許的話，可以建議老師做適當的生物學重復（至少三個）。但就目前高通量研究領域來看，考慮到成本問題，單獨樣品的研究亦可得到學界的一定認可，比如IF在5以下的期刊，還是可以接受無重復的樣本研究。不過隨著時間的推移，做生物重復是必然趨勢。

 

Q19：老師想打開測序結果文件，但是半天沒反應，是怎么回事？

A：這是因為某些文件較大，office軟件（word，記事本等）通常需要將文件整體讀入電腦內存，耗費電腦資源，故速度較慢甚至死機，建議老師可以使用VIM，ultraedit等軟件。

 

Q20：結題報告中某些插件顯示不出來，是怎么回事？

A：這些問題是由于瀏覽器以及java插件的版本兼容問題。但這些東西對于結果的整體解讀不會有很大影響，比如熱圖，這個圖一般不能直接用到文章里，后來可根據老師挑取特定的基因，重新繪制熱圖。