病原微生物的快速檢測(cè)對(duì)疫情的預(yù)防控制至關(guān)重要。基于 PCR 的病原微生物核酸檢測(cè)方法克服了傳統(tǒng)病原微生物培養(yǎng)方法耗時(shí)長(zhǎng)、免疫學(xué)檢測(cè)存在窗口期等問題。然而，對(duì)精確控溫?zé)嵫h(huán)儀的依賴卻嚴(yán)重限制了其在資源匱乏地區(qū)的應(yīng)用。雖然基于核酸等溫?cái)U(kuò)增的病原微生物檢測(cè)方法可擺脫對(duì)高精度溫控設(shè)備的依賴，但仍需要進(jìn)行樣本核酸分離提取、擴(kuò)增與檢測(cè)等步驟。近年來，微流控技術(shù)與核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，誕生了多種病原微生物等溫?cái)U(kuò)增微流控檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)通過設(shè)計(jì)芯片結(jié)構(gòu)、優(yōu)化進(jìn)樣模式及檢測(cè)方式，實(shí)現(xiàn)了病原微生物核酸提取、擴(kuò)增與檢測(cè)一體化，并具備多重檢測(cè)、定量檢測(cè)等功能，具有對(duì)儀器依賴度小、對(duì)操作人員要求不高、樣本量需求小和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，適合于在多種環(huán)境下的病原微生物快速檢測(cè)。

基于重組酶聚合酶擴(kuò)增的病原微生物微流控檢測(cè)技術(shù)

2006 年，Piepenburg等[1]首次提出了重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)(recombinase polymerase amplification, RPA)。它是由重組酶(T4uvsX)、聚合酶(Bsu)和單鏈結(jié)合蛋白(gp32)以及兩條特異性的上下游引物參與的等溫?cái)U(kuò)增。首先，T4 uvsX 在輔助因子 uvsY的作用下與引物結(jié)合形成核酸蛋白復(fù)合物，然后該復(fù)合物尋找與靶標(biāo) DNA 的互補(bǔ)區(qū)域進(jìn)行雜交并置換下另一條單鏈，置換下的單鏈馬上被 gp32結(jié)合防止其再與互補(bǔ)鏈雜交，最后 T4 uvsX 在 ATP 的作用下與引物解離，聚合酶 Bsu 與引物結(jié)合并沿模板進(jìn)行延伸(圖 1)。該反應(yīng)在37~42℃下 30 min 內(nèi)可以獲得1012拷貝的擴(kuò)增產(chǎn)物，其靈敏度可達(dá)到單拷貝，其擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在500 bp 以內(nèi)最佳[1]。由于RPA反應(yīng)快速、靈敏以及恒溫條件溫和等特點(diǎn)，因此易于與微流控芯片結(jié)合開發(fā)出對(duì)病原微生物的即時(shí)檢測(cè)(point-of-care testing,POCT)技術(shù)。

圖1 重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)基本原理

Fig. 1 Principle of recombinase polymerase amplification

1：在重組酶作用下，引物與靶序列結(jié)合；2：引物與靶序列結(jié)合后置換下的單鏈被單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合；3：在聚合酶作用下進(jìn)行延伸，同時(shí)置換下的單鏈被單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合；4：同源雙鏈分離，持續(xù)延伸；5：形成新的雙鏈，并進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)。

基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的病原微生物微流控檢測(cè)技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)由Notomi 等[2]于2000 年首次發(fā)表，該反應(yīng)原理如圖 2 所示。針對(duì)待測(cè)靶標(biāo)設(shè)計(jì)一對(duì)外引物F3、B3 和一對(duì)內(nèi)引物FIP、BIP，在具有鏈置換活性的DNA 聚合酶(Bst DNA 聚合酶)作用下，引物沿模板發(fā)生延伸和鏈置換反應(yīng)，產(chǎn)生長(zhǎng)短不一的靶標(biāo)重復(fù)片段，該反應(yīng)通常在60~65℃進(jìn)行，1 h 內(nèi)將待測(cè)靶標(biāo)擴(kuò)增109倍以上，靈敏度可達(dá)到檢測(cè) 10 拷貝的待測(cè)靶標(biāo)。通過額外引入一對(duì)環(huán)狀引物可顯著提升其檢測(cè)靈敏度并使反應(yīng)時(shí)間縮短至 30 min 內(nèi)。鑒于 LAMP 靈敏度高、檢測(cè)方式多樣、反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，近年來發(fā)展了很多LAMP 微流控芯片，它們?cè)谶M(jìn)樣方式、產(chǎn)物檢測(cè)方法等方面各有千秋，在病原微生物核酸檢測(cè)方面均具有較好的應(yīng)用前景。

圖 2環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增原理

Fig. 2 Principle of loop-mediated isothermal amplification

A：LAMP外引物F3/B3 和內(nèi)引物FIP/BIP 與靶標(biāo)互補(bǔ)的6 個(gè)區(qū)域，如其中F3 與F3c 互補(bǔ)，B3 與B3c互補(bǔ)；B：起始結(jié)構(gòu)產(chǎn)物生成步驟，引物FIP 通過F2 區(qū)域與模板鏈F2c 結(jié)合并進(jìn)行延伸，之后F3 與靶標(biāo)F3c 結(jié)合并進(jìn)行鏈置換反應(yīng)，F(xiàn)IP延伸產(chǎn)物被替換釋放，釋放的單鏈末端形成環(huán)結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)3)。BIP 和B3 以相似的方式進(jìn)行，生成兩端具有環(huán)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物5。C：循環(huán)放大步驟，結(jié)構(gòu)5以自身為模板，從3’末端F1 區(qū)域開始自引發(fā)DNA 合成，同時(shí)FIP 退火至環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的F2c 區(qū)域并進(jìn)行延伸得到結(jié)構(gòu)6。結(jié)構(gòu)6以自身為模板延伸，置換下與結(jié)構(gòu)5 互補(bǔ)的產(chǎn)物7。結(jié)構(gòu)7 到結(jié)構(gòu)8 再到結(jié)構(gòu)5 與結(jié)構(gòu)5 到結(jié)構(gòu)6 再到結(jié)構(gòu)7 類似。結(jié)構(gòu)9 和結(jié)構(gòu)10分別由結(jié)構(gòu)6 和結(jié)構(gòu)8 生成。在環(huán)狀結(jié)構(gòu)與FIP/BIP 引物的共同作用下生成含有多個(gè)重復(fù)靶標(biāo)序列的結(jié)構(gòu)11、12。

基于其他核酸等溫?cái)U(kuò)增的病原微生物微流控檢測(cè)技術(shù)

 基于滾環(huán)擴(kuò)增的病原微生物微流控檢測(cè)技術(shù)

滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification, RCA)是一種具有鏈置換活性DNA 聚合酶催化的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，需要一條鎖式探針與靶序列雜交后連接成環(huán)狀模板，引物與環(huán)狀模板匹配后在DNA 聚合酶作用下沿環(huán)延伸并不斷置換先前產(chǎn)生的延伸鏈，最終產(chǎn)生重復(fù)的長(zhǎng)單鏈DNA 產(chǎn)物(圖 3A)。在RCA 基礎(chǔ)上通過引入與延伸產(chǎn)物退火雜交的另一條或多條引物可形成超分支RCA，實(shí)現(xiàn)超指數(shù)式擴(kuò)增；或通過偶聯(lián)RCA 與核酸侵入反應(yīng)實(shí)現(xiàn)低成本、高靈敏、高特異性的信號(hào)放大核酸檢測(cè)。Jiang 等開發(fā)了一款RCA 芯片，其通道內(nèi)修飾的適配體可捕獲病原微生物，再通過另一適配體引物與菌體結(jié)合形成“三明治”結(jié)構(gòu)，利用適配體引物引發(fā)RCA 反應(yīng)進(jìn)行信號(hào)放大，最后通過熒光探針的雜交進(jìn)行檢測(cè)(圖 3B)，該方法可檢測(cè)102個(gè)細(xì)胞/mL 的E. coli O157:H7。但由于RCA 需要鎖式探針首先與靶標(biāo)連接成環(huán)，連接與擴(kuò)增步驟一般不在同一體系進(jìn)行，因此較難開發(fā)集提取、擴(kuò)增和檢測(cè)于一體的RCA 微流控芯片。

圖3 RCA 反應(yīng)原理及微流控芯片

Fig. 3 Principles of RCA and the microfluidic chip

A：RCA擴(kuò)增原理，環(huán)狀模板兩端與連接模板退火，并進(jìn)行連接，使模板成環(huán)，之后引物與環(huán)狀模板退火后經(jīng)DNA聚合酶進(jìn)行延伸，最終可得到一條含有多個(gè)重復(fù)模板序列的長(zhǎng)DNA 單鏈。B：RCA微流控芯片，在微流控內(nèi)壁修飾由適配體，可將大腸桿菌特異性捕獲。適配體-引物復(fù)合體與被捕獲的大腸桿菌結(jié)合，引物以環(huán)狀DNA為模板進(jìn)行延伸，通過熒光探針對(duì)延伸產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

基于依賴核酸序列擴(kuò)增的病原微生物微流控檢測(cè)技術(shù)

1991年，加拿大Cangene Corporation 公司Jean Compton 實(shí)驗(yàn)室首次提出依賴核酸序列擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)。該方法以單鏈RNA 為模板，在恒溫條件下，通過逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和T7 RNA 聚合酶以及正向引物和反向引物來模擬體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制機(jī)制對(duì)目標(biāo)RNA 進(jìn)行擴(kuò)增(圖 4A)，90min 內(nèi)可以將靶標(biāo)擴(kuò)增至1012，其產(chǎn)物長(zhǎng)度為 100~250 bp，靈敏度可達(dá)檢測(cè)單個(gè)拷貝的靶標(biāo)分子。Wang 等發(fā)展了一種可以進(jìn)行數(shù)字化檢測(cè)的 NASBA芯片(dNASBA)，如圖 4B所示，沿芯片主通道分布多個(gè)獨(dú)立小室，小室最末端伸出分支通道與主通道相通。首先通入油相排除芯片腔體內(nèi)的空氣，進(jìn)樣口加入水相體系并在出樣口連接負(fù)壓，基于流體的固有性質(zhì)及芯片結(jié)構(gòu)，液體會(huì)經(jīng)主通道自動(dòng)填充至每個(gè)分離的小室，但不會(huì)進(jìn)入分支通道，再加入油相填充主通道使每個(gè)小室體系隔離，完成反應(yīng)體系的數(shù)字化分布。然而，NASBA擴(kuò)增步驟多，反應(yīng)體系較復(fù)雜，不易開發(fā)成微流控檢測(cè)芯片，因此基于NASBA 的病原微生物檢測(cè)芯片鮮有報(bào)道。

圖4 NASBA 反應(yīng)原理及微流控芯片

Fig. 4 Principles of NASBA and the microfluidic chip

A：NASBA 擴(kuò)增原理，含有T7 序列的引物1 與靶RNA雜交，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成DNA，加Rnase 使RNA 降解，并加入引物2 與DNA 雜交延伸，生成雙鏈DNA。由雙鏈DNA 經(jīng)T7 RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄生成RNA。然后進(jìn)行循環(huán)。最終生成大量RNA 經(jīng)熒光探針進(jìn)行檢測(cè)。B：NASBA數(shù)字化微流控芯片，首先在干凈的芯片通入油相填充真?zhèn)€芯片，再加入反應(yīng)體系，使反應(yīng)體系填充至每個(gè)小室。由于小室底部通道疏水，因此并不會(huì)經(jīng)小室底部的通道流出。最后再通油相封閉主通道，使每個(gè)小室獨(dú)立分隔。形成數(shù)字化液滴芯片。

基于解旋酶依賴性擴(kuò)增的病原微生物微流控檢測(cè)技術(shù)

在體內(nèi)，DNA 通過解旋酶、DNA 聚合酶及各種輔助蛋白因子進(jìn)行復(fù)制，Vincent 等模仿這一過程開發(fā)出了體外解旋酶依賴性擴(kuò)增法(helicase-dependent amplification, HDA)。該方法原理如圖 5A 所示，首先DNA 雙鏈被DNA 解旋酶(E. coli UvrD helicase)分離為單鏈并分別被單鏈結(jié)合蛋白(single strand DNA-binding protein, SSB)結(jié)合，之后兩條上下游特異性引物分別與模板雜交，在DNA 聚合酶(exo- Klenow)的作用下延伸，合成新的雙鏈，在37℃ 條件下反應(yīng)1~2 h 可獲得106倍的擴(kuò)增產(chǎn)物，其靶序列在400 bp 范圍內(nèi)可以得到有效擴(kuò)增。Mahalanabis 等開發(fā)了一種μSPE-HDA 芯片，可直接將樣本裂解液注入芯片進(jìn)樣孔，流經(jīng)芯片內(nèi)置的固相萃取色譜柱，之后進(jìn)行洗滌洗脫完成DNA 的提取，再將提取的 DNA 和 HDA 反應(yīng)體系直接注入混合室，經(jīng)混勻后進(jìn)入反應(yīng)室(整個(gè)過程通過瓣閥控制廢液、洗脫液和體系的流向) (圖 5B)。然而，HDA 反應(yīng)體系復(fù)雜，反應(yīng)過程難以控制，給基于 HDA 的微流控芯片設(shè)計(jì)帶來了困難。

圖5. HDA 反應(yīng)原理及微流控芯片

Fig. 5 Principles of HDA and the microfluidic chip

A：HDA擴(kuò)增原理，首先雙鏈DNA 經(jīng)解旋酶解旋，單鏈被單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合。引物與單鏈特異性雜交后經(jīng)聚合酶延伸，最后形成新的雙鏈；B：HDA微流控芯片，芯片內(nèi)置SPE 提取柱、反應(yīng)單元、廢液池，各位置開關(guān)閥門可控制液體流向。反應(yīng)末端為疏水出氣孔，可在滿足進(jìn)樣的同時(shí)防止液體流出。各種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在反應(yīng)體系組成、反應(yīng)條件、檢測(cè)方式等方面均各有優(yōu)劣(表1)，但它們依然離不開核酸提取、擴(kuò)增與產(chǎn)物分析等步驟，如何簡(jiǎn)化與集成這些繁瑣操作步驟成為病原微生物核酸現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的關(guān)鍵[3]。而構(gòu)建集病原微生物預(yù)處理、核酸提取、擴(kuò)增與檢測(cè)于一體的等溫?cái)U(kuò)增芯片是未來的發(fā)展方向，并且為了發(fā)展適用于極端惡劣環(huán)境的病原微生物POCT芯片，如何降低對(duì)儀器設(shè)備的依賴性、增強(qiáng)芯片及反應(yīng)體系的穩(wěn)定性、提高檢測(cè)的特異性與定量性能始終是等溫?cái)U(kuò)增病原微生物檢測(cè)芯片需要克服的技術(shù)瓶頸。相信隨著微流控技術(shù)與核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，會(huì)出現(xiàn)定量性能更好、儀器依賴度更低、可分析未知病原微生物序列的核酸等溫?cái)U(kuò)增病原微生物檢測(cè)芯片技術(shù)，使病原微生物即時(shí)檢測(cè)向著集成化、快速、高通量、多重篩查的方向發(fā)展。

表 1  不同核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)比較

Table 1 Summary and comparison of different nucleic acid isothermal amplification methods